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如何使用紫外吸收测量蛋白质浓度

如何使用紫外吸收测量蛋白质浓度

本文关键词: 生物医药吸光度
摘要

无论是进行蛋白质提取,纯化或标记,使用从细胞中提取的蛋白质或用于研究生物分子之间相互作用的标记物,蛋白质都是临床,诊断和研究实验室中的常见样品。 蛋白质浓度的测定是蛋白质研究的关键部分。 在本应用中,我们使用Ocean HDX光谱仪生成牛血清白蛋白(BSA)的浓度标准曲线。 紫外波段的超高灵敏度,超低杂散光和高级光学元件,使得Ocean HDX成为UV吸收测量的理想选择。

介绍

蛋白质是生命的中心。 这些错综复杂的生物分子在细胞过程,新陈代谢,催化生物化学反应和作为结构元素等方面发挥着重要作用,甚至更多。 作为所有生命的重要元素,蛋白质往往是生物医学诊断研究和生命科学研究的主要研究内容。 不管所寻求的答案或蛋白质来源如何,涉及蛋白质的大多数研究开始于量化样品中存在的蛋白质的量。

紫外吸收测量蛋白质浓度

 

蛋白质浓度定量

定量蛋白质浓度的方法分为两组 - 使用UV吸光度的直接检测,或使用与蛋白质反应以制备有色产物,并对其进行比色可见吸光度分析。 在280nm处的直接吸光度测量 - 其中芳族氨基酸:色氨酸,酪氨酸和苯丙氨酸吸收 – 这种检测相对较快,并且不用消耗蛋白质。 使用试剂的比色测定可提供总蛋白质浓度,但蛋白质杂质可能会影响测量结果。

不管用于蛋白质定量的确切方法如何,第一步都是测量感兴趣蛋白质或标准蛋白质的几种稀释度的吸光度。 在直接紫外吸收法的情况下,将280nm处的吸光度相对于每个样品的已知浓度绘图。 根据比尔定律(也称为比尔朗伯定律),溶液的吸光度直接取决于吸收分子的浓度和光线通过样品的光程。 这种关系使我们能够使用为我们已知的蛋白质样品生成的标准曲线来确定未知蛋白质样品的浓度。

 

比尔定律规定...

朗伯比尔

...其中

  • A(λ)是溶液对波长的吸光度值
  • ε(λ)是作为该波长下的吸收分子的摩尔吸光系数或消光系数(L / mol·cm)
  • c是溶液的浓度(mol / L)
  • l是光通过溶液所经过的光程(cm)

未知蛋白质浓度由通过数据点绘制的最佳拟合线进行确定。 请注意,标准曲线的线性部分是唯一用于确定未知样品浓度的区域。 测量值超出标准曲线线性范围的样品必须稀释,直到吸光度落在线性范围内。 基于测量浓度范围之外的数据或超出图的线性区域的浓度预测无效。

我们使用配置用于UV吸光度测量的 Ocean HDX光谱仪来生成牛血清白蛋白(BSA)的标准曲线。  Ocean HDX的高分辨率光学元件使其成为UV吸光度测量的理想选择,并具有超低杂散光以获得更高的最大吸光度水平,另外升级了的光学元件,可在紧凑的空间内提供卓越的性能。

 

实验步骤

用水作为溶剂制备6mg / mL BSA(Sigma P/N A2153)储备溶液并稀释至0.02mg / mL,用于制定预测未知蛋白质样品浓度的标准曲线。值得我们的注意的是,BSA经常用作生成校准曲线以预测蛋白质浓度的标准蛋白质。

使用OCEAN-HDX-UV-VIS光谱仪,DH-2000-BAL平衡氘钨光源,CUV-UV比色皿支架,QP230-2-XSR极度抗紫外光纤两根,并使用OceanView中的吸光度向导进行吸光度测量。 由于BSA不在可见光区域产生吸收,因此我们只需使用氘灯用于测量。 将光源限制在发生吸光度的区域会减少测量中的杂散光,从而为更高浓度的样品提供更高的最大吸光度水平。 光谱仪和光源预热60分钟,通过消除光谱仪和光线升温至一致温度时发生的漂移,提高测量的稳定性。

Ocean HDX

测量是在一个石英比色皿中进行的,该比色皿在测量之间未从比色皿支架上取下。 通过取出0.5mL样品并用0.5mL水替换它,可实现直接在比色皿中进行稀释。 在将水添加到比色皿之后,使用一次性移液管来混合样品,进行稀释至0.02mg / mL。

 

结果

下面的图1显示了使用Ocean HDX测量的蛋白质吸收光谱。  Ocean HDX的超低杂散光性能使我们能够测量280 nm处芳香族氨基酸峰的吸光度,几乎达到3 AU。 注意,测量肽主链在220nm附近吸收的区域的吸光度值超过3AU(数据未显示)。

水中稀释的BSA的吸光度

图1:在水中稀释的BSA的吸光度。 根据比尔定律预测,吸光度在仪器的线性范围内随浓度线性增加至〜2.5 AU。

 

由BSA吸光度数据产生的标准曲线如图2所示。在2.4和2.5 AU之间观察到数据的平衡或滚降。 此滚降表示测量中存在杂散光。 杂散光(以不同程度存在于所有吸光度测量中)限制了系统可测量的最大吸光度值。

 杂散光是来自设计光路外部的光线,无意中落在探测器的任何部位,从而产生错误的读数。 检测器不区分检测器给定像素上的波长,它只是测量撞击检测器的光强度。 由于这个原因,如果光线在探测器上不应有的像素(波长)处着陆,探测器将错误地输出该波长的读数。 这种杂散光通常来自预期的光源,但在光谱仪内散射并落在检测器的错误部分,但它也可能完全来自不同的源。 该灯设置系统可实现的最大吸光率的工作限制,并通过限制系统的黑暗程度来降低信噪比。 杂散光的常见来源包括光栅中的高阶反射,光栅中的缺陷,光谱仪内部的反射以及光谱仪外壳中的光泄漏。  Ocean HDX拥有在改尺寸下最小的杂散光和可测量的最大吸光度水平。

BSA标准曲线

图2:BSA标准曲线包括0至6mg / mL浓度的超过30个数据点。 请注意在2.4到2.5AU之间的光谱的滚降或流平,其中杂散光限制最大吸光度。

 

在图3中,来自最高蛋白浓度的数据点已经从图中去除以评估测量的线性范围。 如R2值的改善,表明该线的方程式更适合并且将提供更准确的蛋白质浓度值,但是在2.5 AU下仍然有一些滚降。其他在4到4.5AU之间的吸光度,需要额外测量来评估该区域的线性。

吸光度测量的近似线性范围的BSA标准曲线

图3:吸光度测量的近似线性范围的BSA标准曲线。

 使用该图,使用最佳拟合线的方程计算未知BSA或其他蛋白质样品的浓度,其中y是未知样品的吸光度值。

 

结论

标准曲线(也称为校准曲线)的是许多生物医学,诊断和生命科学研究实验室中的典型应用。 准确测定蛋白质浓度是涉及蛋白质分析的第一步。 凭借超低杂散光,升级的光学元件和高紫外灵敏度, Ocean HDX非常适合测量紫外吸光度,包括确定未知蛋白质浓度所需的测量。

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